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細胞轉(zhuǎn)染是一種廣泛使用的實驗室技術(shù)，通過將外源核酸（如DNA、mRNA、siRNA等）導(dǎo)入到受體細胞中，在基因功能研究、疾病模型構(gòu)建、蛋白表達及藥物開發(fā)等領(lǐng)域發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而，由于不同來源的細胞具有不同的生理特性，它們對轉(zhuǎn)染條件的敏感性存在顯著差異，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率參差不齊。因此，如何有效提升這一效率已成為科研工作者面臨的重要挑戰(zhàn)。
本期細胞學(xué)堂將分享四個關(guān)鍵優(yōu)化步驟，助您輕松提高轉(zhuǎn)染效率！
選擇適合的轉(zhuǎn)染方法
常見的細胞轉(zhuǎn)染方法包括化學(xué)法、物理法和病毒載體法[1]。
化學(xué)法
化學(xué)法包括脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、DEAE-葡聚糖法、陽離子聚合物轉(zhuǎn)染法等。其原理是利用轉(zhuǎn)染試劑（如陽離子脂質(zhì)體、DEAE-葡聚糖、陽離子聚合物等）與帶負電荷的核酸形成復(fù)合物，并通過內(nèi)吞作用進入細胞，從而實現(xiàn)細胞轉(zhuǎn)染。化學(xué)轉(zhuǎn)染法具有操作簡便、適用范圍廣等優(yōu)點，但也存在一定的細胞毒性[2-4]。因此，針對不同的細胞類型，選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑對轉(zhuǎn)染效果具有決定性影響。
物理法
物理法包括顯微注射法、電穿孔法等[5]。其中，電穿孔方法是利用高壓電流脈沖在細胞膜上形成瞬時微孔，使核酸等生物分子進入細胞。該方法轉(zhuǎn)染效率高，但對細胞的損傷較大，細胞致死率高。
病毒載體法
病毒載體法，如慢病毒、腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。尤其是，慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒可以將基因組整合到宿主細胞中，實現(xiàn)穩(wěn)定且長期的基因表達[6]。然而，病毒載體法存在細胞毒性和潛在的生物安全風(fēng)險，需要嚴格的操作規(guī)范。
根據(jù)細胞類型和實驗?zāi)康倪x擇合適的轉(zhuǎn)染方法至關(guān)重要。對于大多數(shù)貼壁細胞，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染是一種常用且較為溫和的方法；而對于原代細胞或難轉(zhuǎn)染的懸浮細胞，電穿孔或病毒載體轉(zhuǎn)染可能更為合適。
優(yōu)化細胞密度
細胞密度是影響轉(zhuǎn)染效率的重要因素之一。
一般來說，貼壁細胞在70%-90%匯合度時轉(zhuǎn)染效果較好。然而，對于某些特殊的細胞系或轉(zhuǎn)染方法，可能需要調(diào)整細胞密度。建議在轉(zhuǎn)染前一天設(shè)置多個細胞密度梯度進行接種，以便在轉(zhuǎn)染細胞時達到不同的匯合度。轉(zhuǎn)染后，通過實驗評估各組的轉(zhuǎn)染效率和細胞狀態(tài)，以確定細胞密度范圍。
優(yōu)化待轉(zhuǎn)物濃度與轉(zhuǎn)染試劑比例
以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染為例，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑和待轉(zhuǎn)物的比例不同，對轉(zhuǎn)染效率和細胞毒性有顯著影響。
為了優(yōu)化轉(zhuǎn)染效果，建議在細胞消化接種到孔板時，每孔加入等量的細胞懸液，以確保轉(zhuǎn)染時細胞密度的一致性。根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說明書推薦比例，設(shè)置梯度，如轉(zhuǎn)染試劑：待轉(zhuǎn)物比例分別為1:1、2:1、3:1，制備不同濃度的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，分別加入到相應(yīng)的孔中，每個比例設(shè)置3個重復(fù)孔以確保數(shù)據(jù)的可靠性。將培養(yǎng)板置于細胞培養(yǎng)箱中孵育一定時間后，通過熒光顯微鏡觀察或流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率，并用CCK-8法檢測細胞存活率。根據(jù)實驗結(jié)果，選擇轉(zhuǎn)染效率高且細胞毒性低的比例，用于后續(xù)實驗。
優(yōu)化孵育時間
轉(zhuǎn)染后細胞與轉(zhuǎn)染復(fù)合物的孵育時間是影響轉(zhuǎn)染效果的重要因素之一。
孵育時間過短可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)染復(fù)合物未能充分進入細胞，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低；而孵育時間過長則可能增加轉(zhuǎn)染試劑對細胞的毒性，影響細胞狀態(tài)。為了優(yōu)化轉(zhuǎn)染效果，建議在轉(zhuǎn)染后設(shè)置多個時間點（如6 h、12 h、24 h等）更換培養(yǎng)基，并觀察轉(zhuǎn)染效率和細胞毒性變化。對于一些對轉(zhuǎn)染試劑較為敏感的細胞，縮短孵育時間可能有助于降低細胞損傷，同時保持較高的轉(zhuǎn)染效率。通過實驗確定孵育時間，以實現(xiàn)轉(zhuǎn)染效果和細胞活性的平衡。在完成一系列優(yōu)化實驗后，需對結(jié)果進行系統(tǒng)總結(jié)。對比不同條件下轉(zhuǎn)染效率和細胞存活率的數(shù)據(jù)，分析各參數(shù)對轉(zhuǎn)染效果的影響。根據(jù)實驗結(jié)果，總結(jié)出適用于特定細胞系或?qū)嶒烍w系的轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化策略，為后續(xù)實驗提供參考依據(jù)。
案例分享：
Hep G2細胞轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化
實驗?zāi)繕?/strong>
為了確定人肝癌細胞Hep G2的最佳轉(zhuǎn)染條件，本研究將綠色熒光蛋白基因（EGFP）通過不同轉(zhuǎn)染條件導(dǎo)入Hep G2，并觀察其表達情況。
預(yù)實驗
在預(yù)實驗階段，我們選擇了一種常規(guī)的轉(zhuǎn)染試劑，嚴格按照說明書操作。但轉(zhuǎn)染效率非常低，不到10%的細胞表達了熒光蛋白。
優(yōu)化策略
為了提高轉(zhuǎn)染效率，我們從以下幾個方面進行了優(yōu)化。
細胞培養(yǎng)條件：選擇適合HepG2細胞生長的培養(yǎng)基。
轉(zhuǎn)染試劑篩選：測試多款轉(zhuǎn)染試劑，選擇其中一種轉(zhuǎn)染效果佳的，進一步優(yōu)化其轉(zhuǎn)染方案。
質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度：使用高質(zhì)量的質(zhì)粒提取試劑盒和試劑，確保質(zhì)粒的純度和完整性。通過濃度梯度的實驗，測試了轉(zhuǎn)染試劑（μL）與質(zhì)粒（μg）的不同比例（1:1，2:1，3:1，4:1，5:1），觀察不同比例下轉(zhuǎn)染Hep G2細胞的綠色熒光蛋白（EGFP）表達效果。實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒比例為2:1（如圖1）。
轉(zhuǎn)染復(fù)合物孵育時間和孵育溫度：設(shè)置了不同的孵育時間和溫度梯度，觀察其對轉(zhuǎn)染效率的影響。實驗發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染復(fù)合物在室溫（20-25℃）孵育20 min時，轉(zhuǎn)染效果優(yōu)。
實驗結(jié)果
經(jīng)過一系列的優(yōu)化實驗，Hep G2轉(zhuǎn)染效率顯著提高。60%以上細胞表達了熒光蛋白，實現(xiàn)了熒光蛋白基因在Hep G2細胞中的高效表達（如圖2）。
圖1. 轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒不同比例下Hep G2細胞的熒光蛋白表達效果
圖2. 用EGFP表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep G2細胞48 小時后的熒光蛋白表達效果（A：白光圖，B：熒光圖，C：流式檢測轉(zhuǎn)染效率）
細胞轉(zhuǎn)染注意事項
細胞狀態(tài)
細胞狀態(tài)是影響轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵因素之一。應(yīng)確保使用處于對數(shù)生長期且活力良好的細胞，避免使用傳代次數(shù)過多或受污染的細胞。
核酸的質(zhì)量和純度
核酸的質(zhì)量和純度對轉(zhuǎn)染效果至關(guān)重要，應(yīng)使用無內(nèi)毒素的高純度核酸。
實驗設(shè)計
在優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件時，建議設(shè)置空載體對照、未轉(zhuǎn)染組及陽性對照組，以排除干擾因素，確保實驗結(jié)果的可靠性。
細胞類型和轉(zhuǎn)染條件
不同細胞類型對轉(zhuǎn)染方法和條件的要求不同，需根據(jù)具體細胞類型和實驗?zāi)康倪M行調(diào)整。
希望這篇關(guān)于細胞轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化的詳細解析能幫助您提升細胞轉(zhuǎn)染效率！更多細胞培養(yǎng)相關(guān)干貨，請持續(xù)關(guān)注細胞學(xué)堂專欄~
參考文獻
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Fus-Kujawa A, Prus P, Bajdak-Rusinek K, Teper P, Gawron K, Kowalczuk A, Sieron AL. An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2021 Jul 20; 9: 701031.
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Paecharoenchai O, Niyomtham N, Apirakaramwong A, Ngawhirunpat T, Rojanarata T, Yingyongnarongkul BE, Opanasopit P. Structure relationship of cationic lipids on gene transfection mediated by cationic liposomes. AAPS PharmSciTech. 2012 Dec; 13 (4): 1302-8.
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Huang QD, Ren J, Ou WJ, Fu Y, Cai MQ, Zhang J, Zhu W, Yu XQ. Cationic lipids containing cyclen and ammonium moieties as gene delivery vectors.Chemical Biology & Drug Design. 2012 Jun; 79 (6): 879-87.
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